آموزش اصول طراحی پرایمر

بیوتکنولوژی

1396/11/18
971
0

آموزش اصول طراحی پرایمر

طراحی پرایمر  معیار مهم در موفقیت آمیز بودن PCR است. واکنش زنجیره ای پلیمراز یک واکنش آنزیمی است که از اصول ریاضی ساده و قابل فهم پیروی می کند. این واکنش در محیط in vitro قادر به تکثیر یک قطعه از DNA در مقیاس لگاریتمی است که اساس ظهور بیولوژی مولکولی مدرن می باشد؛ چرا که تکثیر انتخابی مولکول های اسید نوکلئیک از یک منبع اولیه با مقدار کم، زمینه بررسی دقیقتر این مولکولها را فراهم می آورد

طراحی پرایمر دارای دو اصل بسیار مهم می باشد:
اول: بحث اصول معماری پرایمرها(شرایط اختصاصی)
دوم: اصول انتخاب پرایمرها با نرم افزار های مناسب (شرایط عمومی).

به عنوان مثال ساخت یک ساختمان را در نظر بگیرید. مهندسان ساخت ساختمان باید یک سری اصول رو رعایت کنند مثلا دیوار ها باید صاف و عمود بر زمین ساخته شوند. سقف باید دارای یک وزن مناسب باشد پس مهندسان ساخت و ساز می تواند دیوار و سقف را درست کند پنجره و درها را نصب کند که این کارها دارای یک سری اصول می باشد.اما نکته که از بسیار مهم می باشد این موضوع است که مهندسان ساخت ساختمان از روی یک نقشه وطرح که توسط معماران اماده میشود باید ساختمان را بسازند. معماران مشخص می کنند که اندازه اتاق ها چه قد باشد جای پنجره و در کجا بشد و .... پس اگر مهندس ساختمان همه اصول ساخت و ساز رو رعایت کنند اما بر اساس طرح معمار پیش نرود ممکن است اتاقی بسازد که نه در دارد نه پنجره. در طراحی پرایمر هم این گونه است.

- اصل اول در طراحی پرایمر
در قسمت معماری پرایمر باید هدف از طراحی پرایمر مشخص باشد. به عنوان مثال اگر برای بررسی بیان ژن پرایمر طراحی شود نباید پرایمر های برروی DNA طراحی شوند و باید برروی mRNA طراحی شوند. در طراحی پرایمر برای واکنش ریل تایم طول قطعه ای که تکثیر می شود نباشد از 200 جفت باز بیشتر شود. در طراحی پرایمر برای تولید پروتئین فیوژن شده پرایمر باید برای ناحیه CDS طراحی شود. ویا در طراحی پرایمر برای توالی یابی یک ناحیه از ژنوم طول قطعه نباید از 600 جفت باز بیشتر شود ( به دلیل اینکه دستگاه های توالی یابی در هر خوانش بیش از 600 جفت باز را سکانس نمی کنند). پس در قسمت معماری پرایمر (مانند معماری ساختمان) باید هدف و تکنیک (مانند روش ریل تایم یا پی سی آر معمولی) مشخص باشد. طراحی پرایمر برای هر تکنیک متفاوت دارای اصول خود می باشد . به دلیل اختصاصی بودن این شرایط برای تکنیک های مختلف و جلوگیری از سردرگمی، این اصول معماری پرایمردر قسمت های آموزش طراحی پرایمر برای تکنیک های مختلف در کانال به صورت جداگانه قرار داده خواهد شد.

اصل دوم در طراحی پرایمر
بحث دوم در آموزش طراحی پرایمر انتخاب پرایمر های می باشد. به عنوان مثال در واکنش ریل تایم گفتیم که طول قطعه باید زیر 200 (ترجیحا حدود 100) جفت باز باید باشد و برروی mRNA باید  طراحی شود، برای ژنی که داری طول mRNA با 10هزار باز می باشد می توان پرایمرهای بسیاری با ویژگی های فوق پیدا نمود اما تنها پرایمرهایی مناسب می باشد که دارای یک سری ویژگی های خاص باشند ( به عنوان مثال در ساخت ساختمان دیواری مناسب است که کج نباشد) به کار بردن این اصول  در انتخاب پرایمر، اختصاصیت و حساسیت PCR را بهبود می بخشد. این اصول شامل ویژگی هایی مانند طول پرایمر، دمای Tm، Ta ، مقدار و درصد بازهای  GC ، نحوه اتصال نوکلئوتیدهای انتهایی پرایمر می باشد. در این آموزش سعی شده است که با ارائه مهم ترین اصول طراحی پرایمر چگونگی طراحی پرایمر نشان داده شود.

در طراحی پرایمر این اصول زیر را باید همیشه مد نظر قرار دهیم: طول‌ متوسط‌ هر پرایمر بین‌ 25-۱۸ جفت ‌باز باشد، پرایمر با طول‌ کوچک‌ اتصال‌ غیر اختصاصی‌ را افزایش‌ داده و پرایمر بزرگ سرعت‌ هیبریداسیون‌ را کم‌ می‌کند

. میزان GC  پرایمر های فوروارد و معکوس شبیه هم  هم باشد که معمولا حدود ۶۰-45 درصد می باشد. پرایمر های مستقیم و معکوس نباید مکمل همدیگر باشند و با یکدیگر ساختار ثانویه تشگیل دهند، زیرا باعث تولید پرایمر دایمر می شود که به ویژه در Real time PCR  مشکل ایجاد می کند.
قرار دادن حداقل یک پورین( G یا C ) در انتهای‌ ۳ پریم پرایمر سبب افزایش کارایی پرایمر میگردد اما قرار دادن یک پیریمیدن (A یا T) سبب افزایش اختصاصیت پرایمر میگردد
باید دقت کرد که انتهای ۳ پریم غنی از پورین نباشد که سبب کاهش اختصاصیت و اتصال های اشتباه به ژنوم می شود.
باید تا حد امکان‌ از توالی‌ های‌ پالیندرومیک‌ (برای مثال GTTAAC ) در  پرایمر جلوگیری‌ کرد، زیرا احتمال تشکیل پرایمر دایمر را افزایش می دهند.

بنابراین در طراحی پرایمر:
طول پرايمر ها بايد بين 18 تا 25 نوکلئوتيد باشد.
دماي Tm  دو پرايمر فوروارد و معکوس بايد نزديک به هم باشد.
پرايمر ها بايد از نظر درصد GC در حد نرمال باشند(حدود 45تا60 درصد).
پرايمر ها نبايد ساختار سنجاق سری تشکيل دهند.
پرايمر ها تشکيل Self-Dimer و یا Hetero-Dimer ندهد.

منبع : پیشگام بیوانفورماتیک

 

اشتراک گذاری

نظرات