بررسی کیفیت پرایمرهای طراحی شده

بیوتکنولوژی

1396/11/24
141
0

بررسی کیفیت پرایمرهای طراحی شده

بعد از طراحی پرایمر به وسیله هر نرم افزاری و یا حتی دریافت توالی پرایمر ها از مقالات معتبر بایستی کیفیت پرایمر های دریافت شده یا طراحی شده مورد بررسی قرار گیرد تا در صورت وجود مشکل از پرایمرهای دیگری استفاده شود برای بررسی کیفیت پرایمر ها 4 مرحله وجود دارد که عبارتند از:

مرحله اول: همخوانی پرایمر طراحی شده با هدف و تکنیک مورد نظر
مرحله دوم: بررسی اصول ساختاری طراحی پرایمر ها
مرحله سوم: بررسی اختصاصیت پرایمرهای طراحی شده در سایت NCBI
مرحله چهارم: بررسی عدم وجود جهش در پرایمر های طراحی شد

مرحله اول: همخوانی پرایمر طراحی شده با هدف و تکنیک مورد نظر : به مثال های زیر توجه کنید:
 اگر برای بررسی بیان ژن پرایمر طراحی شود نباید پرایمر های برروی DNA طراحی شوند و باید برروی mRNA طراحی شوند. در طراحی پرایمر برای واکنش ریل تایم طول قطعه ای که تکثیر می شود نباشد از 200 جفت باز بیشتر شود. پس اگر شما از یک مقاله برای بررسی بیان ژن خود پرایمر انتخاب نموده اید، پرایمر شما باید دارای شرایط فوق باشد.و یا مثال دیگر در طراحی پرایمر برای توالی یابی یک ناحیه از ژنوم طول قطعه نباید از 600 جفت باز بیشتر شود ( به دلیل اینکه دستگاه های توالی یابی در هر خوانش بیش از 600 جفت باز را سکانس نمی کنند). بنابراین طراحی پرایمر برای هر تکنیک متفاوت دارای اصول خود می باشد.

مرحله دوم: بررسی اصول ساختاری طراحی پرایمر ها
این اصول شامل ویژگی هایی مانند طول پرایمر، دمای Tm، Ta ، مقدار و درصد بازهای  GC ، نحوه اتصال نوکلئوتیدهای انتهایی پرایمر می باشد. برای بررسی اصول ساختاری پرایمرها از نرم افزار IDT يا همان Oligo analyzer استفاده میکنیم.

مرحله سوم : بررسی اختصاصیت پرایمرهای طراحی شده در سایت NCBI
وجود باند اضافی در محصول PCR همیشه ناخوشایند بوده مخصوصا در روش های تعیین توالی و یا کلون کردن قطعات بنابراین پس از طراحی پرایمرهای مورد نظر باید اختصاصی بودن پرایمرها را مورد بررسی قرار دهیم تا اطمینان حاصل کنیم که پرایمر های طراحی شد فقط قطعه مورد نظر ما را تکثیر خواهند کرد. برای این منظور به سایت NCBI مراجعه کرده و به بخش BLAST و سپس به Primer Blast مراجعه می کنیم (به ادرس https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast)

مرحله چهارم : بررسی عدم وجود جهش در پرایمر های طراحی شده
در برخی از نواحی ژنوم موجودات فراوانی پلیمورفیسم ها بسیار بالا می باشد و ممکن است فراوانی یک جهش تا 50 درصد نیز باشد. در نظر بگیرید که انتهای 3 یک پرایمر برروی یک جهش قرار بگیرد بنابراین این پرایمر در نمونه هایی که این جهش را دارند اصلا تکثیر انجام نخواهد داد. وجود جهش در میان پرایمر هم می تواند دردسر ساز شود زیرا باعث می شود در نمونه های دارای جهش پرایمر به خوبی متصل نشود.

منبع : پیشگام بیوانفورماتیک

اشتراک گذاری

نظرات