ضرورت محاسبه کارایی PCR در آنالیز داده های ریل تایم

بیوتکنولوژی

1396/11/26
116
0

برچسب ها:

 

ضرورت محاسبه کارایی PCR در آنالیز داده های ریل تایم

 مفهوم کارایی PCR (یا E یا PCR Efficiency) : کارایی PCR به معنی میزان افزایش محصولات در هر سیکل از واکنش PCR ( یا ریل تایم) می باشد.

- ضرورت محاسبه کارایی PCR در آنالیز داده های ریل تایم
- کارایی PCR بین عدد 2 تا 1 متغیر می باشد
- در بهترین شرایط میزان کارایی PCR برابر 2 می باشد. در این حالت محصول PCR در هر سیکل دو برابر می شود.
- در صورت عدم تکثیر محصول در ریل تایم میزان کارایی PCR برابر با 1 خواهد بود.
- مفهوم کارایی پرایمر: کارایی پرایمر برابر است با کارایی PCR منهای 1 که به صورت درصد بیان می شود.
- کارایی پرایمر بین 100درصد (عدد1) تا صفر درصد (عدد صفر) متغیر است.
- در صورتی که کارایی پرایمر برابر 100درصد باشد در نتیجه کارایی PCR برابر با 2 (1+1) خواهد بود.
- در صورتی که کارایی پرایمر برابر 0درصد باشد در نتیجه کارایی PCR برابر با 1 (1+0) خواهد بود.

دلایل ضرورت محاسبه کارایی PCR در آنالیز داده های ریل تایم
- ضرورت محاسبه میزان کارایی پرایمرها و یا میزان E در محاسبه دقیق  میزان fold change برای ارائه دقیق نتایج ریل تایم می باشد.
- مفهوم fold change همان "چند برابر" می باشد، به عبارت بهتر بیان ژن مورد بررسی در نمونه های گروه اول  (مثلا نمونه های سرطانی) نسبت به نمونه های گروه دوم (مثلا نمونه های نرمال) چند برابر افزایش و یا کاهش یافته است.
- در شکل زیر فرمول اولیه محاسبه fold change قابل مشاهده می باشد. در فرمول اولیه از عدد 2 در فرمول استفاده شده است چرا؟ به دلیل اینکه در واکنش ریل تایم (همانند واکنش PCR) میزان محصولات در هر سیکل ریل تایم باید 2 برابر شود. اما در صورتی در هر سیکل محصولات 2 برابر می شود که میزان کارایی PCR برابر با 2 باشد.
- به دلیل اینکه در اغلب موارد میزان کارایی PCR از 2 کمتر است بنابراین باید از فرمول اصلاح شده (شکل زیر) برای محاسبه fold change استفاده شود.

یک مثال برای ضرورت محاسبه کارایی PCR در آنالیز داده های ریل تایم
- اگر میزان -∆∆CP برای نتایج ریل تایم برابر با 3 باشد، میزان fold change محاسبه شده با فرمول ابتدایی (پست فوق) برابر است با 2 به توان 3 که مساوی با 8 برابر می باشد.
- اگر میزان -∆∆CP برای نتایج ریل تایم برابر با 3 و میزان کارایی PCR برای ژن هدف و ژن رفرنس برابر با 1.8 باشد بنابراین fold change محاسبه شده با فرمول اطلاح شده (پست فوق) برابر است با 1.8 به توان 3 و مساوی 5.8 برابر خواهد بود.
با توجه به مثال فوق می توان پی برد که با محاسبه کارایی PCR می توان میزان Fold change را دقیقتر محاسبه نمود.

 

روش های محاسبه کارایی PCR
برای محاسبه میزان کارایی پرایمرها و یا میزان E از دو روش می توان استفاده نمود.
1. استفاده از رقت های متوالی در واکنش ریل تایم و ترسیم منحنی استاندارد و محاسبه شیب خط
2. استفاده از نرم افزار
linregPCR

- روش اول نیازمند تهیه رقت های متوالی از نمونه ها می باشد بنابراین روش اول نیازمند صرف هزینه های بیشتر می باشد
- محاسبه کارایی پرایمرها و PCR با نرم افزار linregPCR نیازمند هزینه اضافی نمی باشد. و با نرم افزار  linregPCR می توان نتایج ریل تایم حاصل از نمونه های اصلی را مورد بررسی قرار داد و به این طریق میزان کارایی پرایمرها و میزان E را محاسبه نمود.
- نرم افزار  linregPCR داده های ریل تایم را بررسی می نماید و با شناسایی ناحیه خطی منحنی ریل تایم (ناحیه window-of-linearity) ، به وسیله تخمین شیب (slope) خط رگرسیون، کارایی پرایمرها و PCR را محاسبه می نماید.

 

منبع : پیشگام بیوانفورماتیک

اشتراک گذاری

نظرات